Αρχική σελίδα » Εξετάσεις / Νοσήματα » Μη επεμβατικός Χρωμοσωμικός Έλεγχος

O προγεννητικός έλεγχος αποτελεί αναπόσπαστο τμήμα της καθημερινής μαιευτικής πράξης, για την πραγματοποίηση του όμως απαιτείται ανάλυση εμβρυϊκού υλικού που λαμβάνεται με επεμβατικές μεθόδους όπως η αμνιοπαρακέντηση και η βιοψία τροφοβλάστης, με μικρό αλλά υπαρκτό κίνδυνο αποβολής (~1%). Για το λόγο αυτό αναζητούνται συστηματικά μη επεμβατικοί τρόποι λήψης εμβρυϊκού υλικού, έτσι ώστε η προγεννητική διάγνωση να μπορεί να εφαρμοστεί σε όλες τις εγκύους, ανεξαρτήτως ηλικίας ή αντικειμενικού κινδύνου που έχουν να αποκτήσουν παιδί με κάποιο γενετικό νόσημα.

Η απομόνωση ακέραιων εμβρυϊκών κυττάρων, κυρίως εμβρυϊκών ερυθροβλαστών, που περιέχουν ολόκληρο το γονιδίωμα έχει τη δυνατότητα μη επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης με ευαισθησία, αξιοπιστία και ειδικότητα ανάλογη των επεμβατικών τεχνικών. Η μέθοδος εφαρμόστηκε αρχικά για τη μη επεμβατική προγεννητική ανίχνευση αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών και μονογονιδιακών νοσημάτων. Η σπανιότητα όμως των εμβρυϊκών αυτών κυττάρων (1:105-1:109 μητρικά κύτταρα), η έλλειψη ενός ειδικού δείκτη που να διευκολύνει τον εντοπισμό τους και η χρονοβόρα διαδικασία που απαιτείται για την απομόνωση εμποδίζει, προς το παρόν τουλάχιστον, τη χρησιμοποίηση των κυττάρων αυτών στη κλινική πράξη.

Η ύπαρξη ελεύθερου εμβρυϊκού DNA (cell free fetal DNA-cffDNA) στο πλάσμα και τον ορό εγκύων αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1997 από τους Lo και συν., οι οποίοι ανίχνευσαν αλληλουχίες του χρωμοσώματος Υ στο περιφερικό αίμα εγκύων που κυοφορούσαν έμβρυο αγόρι. Η διαπίστωση αυτή επιβεβαιώθηκε από διάφορες επιστημονικές ομάδες και έδωσε νέες δυνατότητες ανάπτυξης μη επεμβατικών τεχνικών προγεννητικού ελέγχου.

Το ελεύθερο εμβρυϊκό DNA ανιχνεύεται στη μητρική κυκλοφορία πολύ νωρίς κατά την κύηση . Αποτελείται κυρίως από μικρά θραύσματα DNA, 80% των οποίων έχουν μέγεθος < 200bp και αντιπροσωπεύει κατά μέσο όρο ποσοστό 3% έως 6% του συνολικού ελεύθερου DNA στο πλάσμα της εγκύου. Η απόλυτη συγκέντρωση cffDNA στο περιφερικό αίμα της εγκύου αυξάνει σημαντικά με τη πρόοδο της κύησης, ενώ ο χρόνος παραμονής του στην μητρική κυκλοφορία μετά τη γέννηση είναι μόλις 16.3 min, γι αυτό και η ανίχνευσή του θεωρείται ειδική για κάθε κύηση. Αύξηση έχει επίσης παρατηρηθεί σε κυήσεις εμβρύων με αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες και σε επιπλοκές της κύησης όπως στην προεκλαμψία. Το cffDNA προέρχεται κυρίως από απόπτωση και νέκρωση εμβρυϊκών συνκυτιοτροφοβλαστικών κυττάρων του πλακούντα.

Η δυσκολία πραγματοποίησης μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου από cffDNA που απομονώνεται από τη μητρική κυκλοφορία οφείλεται στη μικρή ποσότητα cffDNA στο πλάσμα της εγκύου, το πολύ μικρό ποσοστό cffDNA σε σχέση με το μητρικό, τις ατομικές διαφορές στη συνολική συγκέντρωση ελεύθερου DNA στο πλάσμα και τις ομοιότητες του εμβρυϊκού με το μητρικό γενετικό υλικό αφού το έμβρυο κληρονομεί το μισό γενετικό υλικό από τη μητέρα.

Παρά τις τεχνικές δυσκολίες που προαναφέρθηκαν όσον αφορά την απομόνωση και μοριακή μελέτη του cffDNA που απομονώνεται από το πλάσμα της εγκύου, η μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση έχει σήμερα ένα σημαντικό αριθμό κλινικών εφαρμογών που περιλαμβάνουν τον:

  1. προσδιορισμό του φύλου του εμβρύου.
  2. προσδιορισμό του συστήματος Rhesus του εμβρύου σε κυήσεις RhD-αρνητικών γυναικών.


Προσδιορισμός του φύλου του εμβρύου

Ένδειξη για προγεννητικό προσδιορισμό του φύλου του εμβρύου έχουν κυήσεις με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης φυλοσύνδετου νοσήματος ή ενδοκρινολογικής διαταραχής όπως η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων, κυήσεις με οικογενειακό ιστορικό που συνδέεται με ανωμαλίες των έξω γεννητικών οργάνων και υπερηχογραφικά ευρήματα που υποδηλώνουν την πιθανή ύπαρξη γενετικού συνδρόμου, στο οποίο τα αμφίβολα έξω γεννητικά όργανα ή η αναστροφή του φύλου περιλαμβάνονται στο φάσμα των κλινικών εκδηλώσεων. Είναι γνωστό ότι αγόρια που γεννιόνται από μητέρες φορείς φυλοσύνδετων νοσημάτων έχουν 50% κίνδυνο να εμφανίσουν τη νόσο, ενώ τα κορίτσια, κατά κανόνα, δεν εκδηλώνουν το πρόβλημα αλλά έχουν 50% πιθανότητα να είναι φορείς όπως οι μητέρες τους. Η μη επεμβατική προγεννητική ανίχνευση του φύλου του εμβρύου νωρίς κατά τη κύηση και πριν τη βιοψία τροφοβλάστης, έχει τη δυνατότητα να ελαττώσει κατά το ήμισυ σχεδόν τον αριθμό των επεμβατικών προγεννητικών ελέγχων περιορίζοντάς τους μόνο στις εγκύους που κυοφορούν έμβρυο αγόρι. Η μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση του φύλου του εμβρύου αποτελεί την πρώτη κλινική εφαρμογή μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου από cffDNA και γίνεται, είτε με ανίχνευση του γονιδίου SRY στο πλάσμα της εγκύου ή του γονιδίου DYS14 . Η ανίχνευση των εμβρύων κοριτσιών γίνεται έμμεσα, στις περιπτώσεις που δεν ανιχνεύονται αλληλουχίες του χρωμοσώματος Υ στο υπό μελέτη δείγμα. Πριν την αιμοληψία συνιστάται υπερηχογραφικός έλεγχος προκειμένου να επιβεβαιωθεί η βιωσιμότητα του εμβρύου και να αποκλειστεί η παρουσία δεύτερου κενού σάκου. H διάγνωση είναι εφικτή ήδη από την 7η εβδομάδα της κύησης με ακρίβεια και ειδικότητα που πλησιάζει το 100%. Πρέπει να σημειωθεί ότι ασφαλής υπερηχογραφικός προσδιορισμός του φύλου μπορεί να γίνει μετά την 11η- 12η εβδομάδα.

Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα οφείλονται στην χαμηλή ευαισθησία της μεθόδου ανίχνευσης και τη μικρή ποσότητα cffDNA στο δείγμα και μπορούν να αποφευχθούν με την ταυτόχρονη μελέτη δεικτών που επιβεβαιώνουν τη παρουσία cffDNA (πολυμορφικοί ή επιγενετικοί δείκτες). Η επιμόλυνση του δείγματος είναι η κυριότερη αιτία ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων που μπορούν εύκολα όμως να προληφθούν με την τήρηση αυστηρών κανόνων προστασίας από επιμολύνσεις.


Μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση του συστήματος RhD του εμβρύου

Έλλειψη ολόκληρου του RhD γονιδίου ευθύνεται για την πλειονότητα των αρνητικών φαινοτύπων στους Καυκάσιους και για το λόγο αυτό η διάγνωση στοχεύει στην ανίχνευση εξονίων του RhD. Στα RhD-αρνητικά άτομα, η επαφή με την RhD πρωτεΐνη μπορεί να προκαλέσει ανοσολογική αντίδραση η οποία προκύπτει από την παραγωγή αντισωμάτων έναντι ποικιλίας επιτόπων της πρωτεΐνης. Ανοσοποίηση λόγω ασυμβατότητας του συστήματος Rh στις περιπτώσεις RhD-αρνητικής μητέρας και RhD-θετικού εμβρύου θεωρείται η συχνότερη αιτία της αιμολυτικής νόσου του εμβρύου και του νεογνού. Η αιμολυτική αναιμία προκαλείται από λύση των εμβρυϊκών RhD-θετικών ερυθρών αιμοσφαιρίων από τα μητρικά αντί-D αντισώματα τα οποία διαπερνούν τον πλακούντα και μπορεί να οδηγήσει σε αναιμία, εμβρυϊκό ύδρωπα ή και ενδομήτριο θάνατο.

Εάν το έμβρυο είναι RhD-αρνητικό δεν υπάρχει ανάγκη για περαιτέρω έλεγχο και θεραπεία. Όταν όμως το έμβρυο είναι RhD-θετικό, η εγκυμοσύνη θεωρείται υψηλού κινδύνου και παρακολουθείται στενά προκειμένου να διαγνωσθεί έγκαιρα τυχόν ευαισθητοποίηση της εγκύου ή αιμολυτικής νόσος του εμβρύου – νεογνού.

Στη χώρα μας, όπως και στις περισσότερες Ευρωπαϊκές χώρες, μέχρι σήμερα ο κίνδυνος ευαισθητοποίησης της εγκύου αντιμετωπίζεται με την προληπτική χορήγηση υπεράνοσης αντί-RhD σφαιρίνης σε όλες τις RhD αρνητικές εγκύους, ανεξάρτητα από το RhD σύστημα του εμβρύου. Υπολογίζεται όμως ότι το 40% των RhD-αρνητικών εγκύων λαμβάνει άσκοπα ανοσοπροφύλαξη, αφού κυοφορούν RhD-αρνητικό έμβρυο. Η ασυμβατότητα RhD μεταξύ μητέρας και εμβρύου έχει ως αποτέλεσμα την ευαισθητοποίηση της μητέρας και τη εμφάνιση αιμολυτικής νόσου του νεογνού ή του εμβρύου σε επόμενη κύηση. Πρέπει να σημειωθεί ότι η αντί- D σφαιρίνη προέρχεται από ανθρώπινο ορό και παρ΄ όλους τους ελέγχους υπάρχει κίνδυνος μετάδοσης σοβαρού νοσήματος . Η δυνατότητα μη επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης του συστήματος RhD του εμβρύου περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1997, με την ανίχνευση στο πλάσμα της εγκύου πατρικής προέλευσης αλληλομόρφων του RhD γονιδίου τα οποία απουσιάζουν από το γονιδίωμα της μητέρας. και μέχρι σήμερα έχει πραγματοποιηθεί μεγάλος αριθμός μελετών εκτίμησης της αξιοπιστίας και της ειδικότητας και στις περισσότερες περιπτώσεις ξεπερνά το 95% . Ψευδώς θετικά αποτελέσματα οφείλονται σε επιμόλυνση του δείγματος ή συχνότερα στην ύπαρξη πολυμορφικού RhD αλληλομόρφου, ενώ τα ψευδώς αρνητικά σε αδυναμία ανίχνευσης cffDNA στο υπό μελέτη δείγμα. Για το λόγο αυτό, όταν δεν επιβεβαιώνεται η παρουσία εμβρυικού υλικού, συνιστάται επανάληψη λίγες εβδομάδες αργότερα. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί ένας εμβρυικός δείκτης (πχ του RASFF1A) που να επιβεβαιώνει την παρουσία εμβρυικού υλικού.

Σήμερα, η μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση του συστήματος RhD του εμβρύου παρέχεται ως κλινική υπηρεσία σε πολλές Ευρωπαϊκές χώρες, για πληθυσμιακό έλεγχο όλων των RhD αρνητικών εγκύων με προφανή οφέλη.

Στην Ελλάδα, στο Εργαστήριο Ιατρικής Γενετικής Πανεπιστημίου Αθηνών έχουν προτυπωθεί και εφαρμόζονται σήμερα σε διαγνωστικό επίπεδο πρωτόκολλα μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου τόσο του συστήματος RhD όσο και του φύλου του εμβρύου από cffDNA που απομονώνεται από το περιφερικό αίμα της εγκύου.


Βιβλιογραφία

1. Bianchi DW. Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis. Br J Haematol 1999, 105:574–583.

2. Chan KCA, Ding C, Gerovassili A, Yeung SW, Chiu RWK, Leung TN, Lau TK, Chim SSC, Chung GTY, Nicolaides KH, et al. Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: a universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Clin Chem 2006, 52:2211–2218.

3. Finning K, Martin P, Summers J, Massey E, Poole G, Daniels G. Effect of high throughput RHD typing of fetal DNA in maternal plasma on use of anti-RhD immunoglobulin in RhD negative pregnant women: prospective feasibility study. Br Med J 2008, 336:816–818.

4. Kolialexi A, Tounta G, Mavrou A. Non-invasive fetal RhD genotyping from maternal blood. Expert Review of Molecular Diagnostics 2010, 10(3):285-96.

5. Lo YMD, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997, 350:485–487.

6. Minon JM, Gerard C, Senterre JM, Schaaps JP, Foidart JM. Routine fetal RHD genotyping with maternal plasma: a four-year experience in Belgium. Transfusion 2008, 48:373–381.

7. Rijnders RJP, van der Schoot CE, Bossers B, de Vroede MAMJ, Christiaens GCML. Fetal sex determination from maternal plasma in pregnancies at risk for congenital adrenal hyperplasia. Obstet Gynecol 2001, 98:374–378.

8. Scheffer PG, van der Schoot CE, Page-Christiaens GC, Bossers B, van Erp F, de Haas M. Reliability of fetal sex determination using maternal plasma. Obstet Gynecol 2010,115(1):117-26.